摘要：正常免疫的角膜中的炎癥可引發(fā)病理性血管生成反應(yīng)，導(dǎo)致威脅視力的角膜新生血管。然而，炎癥通路是眾多的、復(fù)雜的并且以時間依賴的方式被激活。有效解決角膜中的炎癥和相關(guān)血管生成需要了解這些途徑及其時間依賴性，迄今為止，這些途徑在很大程度上尚未被探索。使用內(nèi)源性炎癥模型誘導(dǎo)的角膜新生血管模型，我們研究了炎癥基因在影響毛細(xì)血管退行和角膜透明度恢復(fù)中的時間依賴性。大鼠角膜內(nèi)源性毛細(xì)血管退行性變的特點是血管新生毛細(xì)血管逐漸變薄和重塑，炎癥細(xì)胞在體內(nèi)消退。通過全基因組縱向微陣列分析，通過全基因組縱向微陣列分析，VEGF配體受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥通路的早期抑制先于LXR/RXR、PPARα/RXRα和STAT3信號通路，同時減弱LPS/IL-1對RXR功能和Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用。潛在的下游炎性細(xì)胞因子如Cxcl5、IL-1β、IL-6和Ccl2在重塑階段同時下調(diào)。炎癥通路上游調(diào)節(jié)因子包括SOCS3、SPARC和ApoE。促炎與抗炎信號通路之間復(fù)雜且協(xié)調(diào)的時間依賴性相互作用突出了LXR/RXR、PPARα/RXRα和STAT3信號通路在解決炎性角膜血管生成中的潛在抗炎作用。

關(guān)鍵詞：角膜新生血管  炎癥  新生血管形成  重塑

簡介：在炎癥反應(yīng)早期，局部損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)，促進(jìn)白細(xì)胞從周圍角膜緣和結(jié)膜區(qū)域的毛細(xì)血管和組織遷移到受影響部位的角膜。炎性細(xì)胞促進(jìn)進(jìn)一步的細(xì)胞因子產(chǎn)生，建立細(xì)胞因子濃度梯度，導(dǎo)致隨后的緣毛細(xì)血管擴(kuò)張和新生血管萌發(fā)。解決炎癥對于管理角膜新生血管是至關(guān)重要的；然而，各種激活的炎癥途徑及其時間重要性仍不清楚。角膜炎癥可隨時間自然消退，據(jù)報道，毛細(xì)血管回歸與M2表型巨噬細(xì)胞的聚集有關(guān)。如NF-κB、PI3 K和cAMP等途徑參與炎癥的凋亡消退，但這僅表現(xiàn)在確定的細(xì)胞類型中。鑒定與病理性角膜炎癥和血管生成有關(guān)的許多重要炎性細(xì)胞因子和因素，這些因素是以協(xié)調(diào)的方式作用的。臨床上類固醇被廣泛用于抑制炎癥；然而，這些藥物同時和不加區(qū)分地靶向許多炎癥和生理通路，導(dǎo)致包括青光眼和白內(nèi)障在內(nèi)的副作用的風(fēng)險。因此，深入研究參與炎癥的關(guān)鍵炎癥途徑以及由此產(chǎn)生的血管生成反應(yīng)可為針對特異性激活的炎癥途徑的改進(jìn)治療鋪平道路。我們之前已經(jīng)證實抑制炎癥和血管生成基因是早期消退期毛細(xì)血管重構(gòu)的特征。在這項研究中，我們假設(shè)不只是炎癥通路抑制的啟動對于血管回歸是重要的。炎癥通路的持續(xù)抑制以及其它血管重構(gòu)通路的同時激活表征了隨時間的衰退和重塑過程。

結(jié)果：分層聚類分析揭示炎癥性血管生成和毛細(xì)血管重塑的時間依賴性差異：采用縫線誘導(dǎo)的大鼠角膜炎癥血管生成模型，研究炎癥介導(dǎo)的角膜新生血管叢隨時間的變化。兩個尼龍縫合線置于基質(zhì)內(nèi)誘導(dǎo)早期炎癥反應(yīng)，隨后從邊緣處預(yù)先存在的毛細(xì)血管向縫合線方向萌發(fā)。當(dāng)新的毛細(xì)血管芽到達(dá)縫合線的一半（指定為時間點0h）時，將各組大鼠分為重塑臂和萌芽臂。在重塑臂中，在0小時取出縫線以誘導(dǎo)隨后的毛細(xì)血管回歸，而在萌芽臂中保留縫合線以提供炎性血管生成的持續(xù)刺激。根據(jù)用于監(jiān)測新生血管反應(yīng)的數(shù)字圖像，在24-120小時期間，重塑臂相對于萌芽臂可見水腫和炎癥被抑制。IVCM檢查顯示，浸潤性炎癥細(xì)胞在萌芽臂角膜基質(zhì)中持續(xù)存在，而在重塑臂角膜基質(zhì)中不存在。此外，巨噬細(xì)胞是重塑臂中72和120小時的主要炎性細(xì)胞類型。使用體內(nèi)共聚焦顯微鏡來監(jiān)測角膜中的毛細(xì)血管灌注和細(xì)胞浸潤，觀察到萌芽臂和重塑臂中的毛細(xì)血管隨時間收縮。然而，在24和72小時，重塑臂的收縮更大。對單個大鼠的整個轉(zhuǎn)錄組微陣列數(shù)據(jù)的分層聚類分析顯示在給定時間點聚集。在萌芽臂中，重疊發(fā)生在0和24小時之間，然而，一個獨特的聚類模式，從24到120小時。在重塑臂中，樣本根據(jù)時間點單獨聚類。在發(fā)芽臂和重塑臂中觀察到的聚集模式表明強(qiáng)烈的時間依賴性轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

差異通路分析揭示時間依賴性炎癥通路抑制和重塑途徑激活：初步篩選了DEG和QIAGEN知識庫之間顯著重疊的富集路徑，其中p值<0.05被認(rèn)為是顯著的，并且進(jìn)一步分析了滿足該標(biāo)準(zhǔn)的路徑?？绫鄣臅r間依賴性通路分析表明在重塑臂中有兩個通路富集的階段。在第一階段，在24h早期，一些關(guān)鍵的炎癥和血管生成途徑被抑制，包括ILK信號、IL-6信號、內(nèi)皮素-1信號、VEGF家族受體配體信號、Jak/stat和ERK5信號。在第二個階段72h末期，LXR/RXR和STAT3通路在重塑臂中被激活，同時抑制了LPS/IL-1通路對RXR功能的影響。LXR/RXR途徑在萌芽臂的同一時間點受到相反抑制。這三條通路的激活/抑制模式在重塑臂中持續(xù)120小時。此外，在萌芽臂中72小時激活的許多炎癥通路在重塑臂中不再活躍。此外，PPARα/RXRα激活途徑在萌芽(抑制)臂和重塑(激活)臂之間有差別的調(diào)節(jié)。分析還揭示了其他可能感興趣的炎癥和重塑途徑，如IL-8信號、大腸癌轉(zhuǎn)移和Wnt/β-連環(huán)素信號。在重塑臂中，激活途徑LXR/RXR激活和STAT3以及抑制途徑Wntβ連環(huán)素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和LPS/IL-1抑制RXR功能，在72～120h呈現(xiàn)持續(xù)激活/抑制狀態(tài)。著眼于重塑臂，我們接下來識別和評估這些途徑中涉及的基因的時間依賴性。

重塑臂內(nèi)富集途徑中的基因具有時間依賴性表達(dá)模式：如上所述，在重塑臂中72和120小時之間比較在晚期重塑階段富集的典型通路中的DEG。在激活途徑LXR/RXR激活和STAT3中的許多基因，以及抑制通路Wntβcatenin信號和LPS/IL-1抑制RXR功能的基因，在兩個時間點都是共同的。此外，評估了富含重塑臂途徑選擇的基因相對于0h(縫線移除時間)從24到120h的時間變化，所有被檢測的基因在萌芽和重塑臂之間均具有p值<0.05。在LXR/RXR信號通路中，促炎性細(xì)胞因子如S100鈣結(jié)合蛋白A8（S100A8）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP9）隨著時間的推移逐漸抑制，而Vegfa和Vegfc在ILK和VEGF配體受體信號通路中逐漸被抑制。

LXRS在不同細(xì)胞群體的角膜中表達(dá)：本文用角膜組織切片免疫熒光法和角膜裂解物免疫印跡法檢測LXRα和LXRβ蛋白在角膜中的表達(dá)。在自然角膜中，LXRα和LXRβ在上皮表層和基底細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。在縫合的角膜中，這些受體的表達(dá)與浸潤的炎性細(xì)胞有關(guān)，而上皮的表達(dá)在萌芽期間減少。相反，在重塑過程中，由于存在較少的炎性細(xì)胞，整體基質(zhì)表達(dá)減少，而上皮表達(dá)被重新建立。強(qiáng)調(diào)重塑臂72h的時間點，CD45 +、CD68 +和CD163+細(xì)胞共表達(dá)LXRα和LXRβ。CD45+白細(xì)胞亞群表達(dá)LXRα和LXRβ，包括CD68+單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和CD163+重塑巨噬細(xì)胞。

LXR下游的基因和原型炎癥基因在角膜組織重塑和萌芽過程中受到不同程度的調(diào)控：LXR活性的下游靶點：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體a1（Abca1）和載脂蛋白E（ApoE）分別在角膜橫切面上與CD68+和CD163+細(xì)胞相關(guān)聯(lián)?；蛐酒^察ABCA1和ApoE的表達(dá)趨勢。研究LXR和PPAR激活對促炎基因具有抑制作用。我們和其他人先前已經(jīng)證實在炎癥性角膜血管生成中細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)。通過qPCR，觀察到C-X-C基序趨化因子配體5(Cxcl5)、趨化因子(C-C基序)配體2(Ccl2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)在72h時點與發(fā)芽臂相比在毛細(xì)血管重塑中均受到抑制，從微陣列數(shù)據(jù)中確定基因表達(dá)的趨勢。

重塑反應(yīng)的上游調(diào)控分析：上游調(diào)控分析是建立在給定上游調(diào)節(jié)器的編碼蛋白活性的預(yù)測上，而不是圍繞分子的基因表達(dá)譜的預(yù)測。該分析有助于識別識別驅(qū)動分子在實驗數(shù)據(jù)中觀察到的基因表達(dá)譜。我們分析了具有偏向于觀察到的LXR/RXR優(yōu)先激活和PPAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游調(diào)控因子在重塑中的作用。24h的上游調(diào)節(jié)分析顯示細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(Socs3)作為唯一激活的上游調(diào)節(jié)因子(激活z評分2)，其中MYC原癌基因、bHLH轉(zhuǎn)錄因子(Myc)和IL-1β是最受抑制的調(diào)節(jié)分子(抑制z評分分別-2和分別為-4.5）。分析顯示Socs3激活A(yù)bca1，它是LXR調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的中心分子之一。72h時，Myc和IL-1β進(jìn)一步受到抑制（抑制z評分分別為-4.2和-4.1），而分泌酸性蛋白和富含半胱氨酸的基因（Sparc）被激活（激活z評分2）。發(fā)現(xiàn)SPARC激活膠原COL1A1和COL1A2等。120h時，Myc和IL-1β受到抑制，72h時明顯升高，而ApoE和Sparc則被激活（激活z值分別為2和2.5）。我們發(fā)現(xiàn)ApoE可以調(diào)節(jié)許多基因，但最重要的是，可以激活參與LXR活性的Abca1和Abca2。

結(jié)論：在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)角膜炎癥的解決是一個時間依賴的過程，其特點是炎性細(xì)胞從基質(zhì)中消失，新生血管變薄，促血管生成和促炎途徑的強(qiáng)烈下調(diào)以及促炎癥通路和炎癥基因如CXCL5、IL-1β、IL-6和CCL2的抑制。在VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和其他血管生成和炎癥通路的初始抑制后，LXR/RXR、PPARα/RXRα和STAT3通路的進(jìn)行性激活，可能是本研究所觀察到的炎癥消退和毛細(xì)血管重構(gòu)的原因。 這些途徑及其相互作用的研究值得密切關(guān)注。SOCS3、SPARC和ApoE等因素可能是這些過程的上游調(diào)控因素，也值得進(jìn)一步研究。